Testarea stabilității microsomale

Întrebări și răspunsuri privind stabilitatea microsomală

Explicați beneficiile utilizării microsomelor hepatice pentru studiile de metabolizare a medicamentelor?

Hepaticul este principalul organ de metabolizare a medicamentelor în organism. Fracțiunile subcelulare, cum ar fi microsomii hepatici, sunt modele utile in vitro de clearance hepatic, deoarece conțin multe dintre enzimele de metabolizare a medicamentelor care se găsesc în ficat. Microsomii sunt ușor de preparat și pot fi depozitați pentru perioade lungi de timp. Aceștia sunt ușor adaptabili la screening-uri de mare randament, care permit depistarea rapidă și ieftină a unui număr mare de compuși.

Vă rugăm să oferiți o prezentare generală a testului de stabilitate microsomală al Cyprotex.

Microzomii sunt incubați cu compusul de testat la 37°C în prezența co-factorului, NADPH, care inițiază reacția. Reacția se termină prin adăugarea de metanol care conține standard intern. În urma centrifugării, supernatantul este analizat pe LC-MS/MS. Dispariția compusului testat este monitorizată pe o perioadă de 45 de minute. Un exemplu de profil tipic de dispariție este prezentat în figura 3.

Figura 3
Graficul arată dispariția compusului de testat în funcție de timp în prezența microsomelor hepatice.

Raportul zonei de vârf ln (zona de vârf a compusului/zona de vârf a standardului intern) este trasat în funcție de timp și se determină gradientul liniei.

Cum se interpretează datele din testul de stabilitate microsomală?

Există mai multe moduri în care pot fi utilizate datele. În primul rând, compușii pot fi clasificați în funcție de valorile lor de clearance intrinsec. Cu excepția cazului în care compusul este un pro-drog, compușii cu clearance foarte ridicat sunt, în general, considerați nefavorabili, deoarece este probabil ca aceștia să fie eliminați rapid in vivo, ceea ce duce la o durată scurtă de acțiune. Benzile de clasificare pot fi utilizate pentru a clasifica compușii în categorii de clearance scăzut, mediu sau ridicat. Benzile de clasificare CLint pentru fiecare specie din tabelul 1 sunt calculate pornind de la o rearanjare a modelului bine agitat4 detaliat în următoarea ecuație, presupunând un raport de extracție (E) de 0,3 și, respectiv, 0,7 pentru limitele scăzută și ridicată. Aceasta poate fi apoi scalată la clearance-ul intrinsec (µL/min/mg de proteină) folosind greutățile hepatice relevante5 și concentrația de proteine microsomale6, 7 obținute din literatura de specialitate. Din cauza lipsei de informații din literatură, concentrația de proteine microsomale la maimuțe și șoareci a fost presupusă la 50 mg de proteine microsomale/g ficat.

CLint =

Unde CLH = E x QH

QH = fluxul sanguin hepatic (ml/min/kg)5
E = raportul de extracție
CLH = Clearance hepatică (ml/min/kg)
fu = fracția nelegată în plasmă (presupusă la 1)

Categoria de Clearance Clearance intrinsecă (µL/min/mg proteine)
Uman Maimuță Câine Șobolan Șoarece
Low < 8.6 < 12.5 < 5.3 < 13.2 < 8.8
High > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

Tabelul 1: Benzile de clasificare utilizate de obicei pentru clasificarea compușilor în clearance scăzut, mediu sau ridicat.

În al doilea rând, datele pot fi utilizate împreună cu alți parametri in vitro pentru a prezice farmacocinetica unui compus in vivo, utilizând software-ul de simulare Cloe PK. În al treilea rând, pot fi investigate diferențele specifice speciilor în metabolismul medicamentelor. Acest lucru poate fi util în identificarea unei specii adecvate pentru dezvoltarea preclinică.

De ce aș testa compușii mei în testul de stabilitate microsomală mai degrabă decât în testul de stabilitate hepatocitară?

Microsomele sunt adaptabile la screeningul de mare randament și permit testarea unui număr mare de compuși la un preț redus. Clienții noștri tind să utilizeze acest test ca screening inițial pentru a clasifica compușii de interes din punct de vedere al stabilității lor metabolice și apoi să efectueze un screening secundar pe un număr mai mic de compuși selectați folosind hepatocite.

Ce controale sunt utilizate în test?

– Sunt incluși doi compuși de control pozitiv pentru fiecare specie. Se știe că acești compuși sunt metabolizați de microsomii hepatici.

.

.

Specii Compuși de control
Humane Dextrometorfan
Verapamil
Șobolan Diazepam
Difenhidramină
Șoarece Diazepam
Difenhidramină
Șoarece Diazepam
Difenhidramină
Maimuță Quinidină
Verapamil
Câine Dextrometorfan
Verapamil

– Se efectuează o incubare de control în absența NADPH pentru a evidenția orice instabilitate chimică sau nondegradare enzimatică dependentă de NADPH.

– Se include un martor care conține toate componentele reacției, cu excepția compusului testat. Acest martor identifică orice potențială componentă de interferență care ar putea afecta analiza.

Pot investiga metabolismul de fază II în microsomi hepatici?

Sondajul de stabilitate microsomală este utilizat în principal pentru a investiga metabolismul de fază I folosind NADPH ca și cofactor enzimatic. Cu toate acestea, microsomii hepatici pot fi, de asemenea, utilizați pentru a studia metabolismul de fază II dacă se folosesc condițiile corecte de incubare. Am validat recent acest lucru folosind agentul de formare a porilor, alameticina, împreună cu cofactorii corespunzători ai fazei II, de exemplu UDPGA. Acest lucru vă permite să obțineți o înțelegere a contribuției pe care metabolismul de fază II o are asupra metabolismului global al unui compus de testare. De asemenea, este posibil să se studieze metabolismul cuplat al fazei I și al fazei II prin utilizarea tuturor cofactanților relevanți în incubare.

.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.