Ensaio de estabilidade microssomal

Perguntas e respostas sobre estabilidade microssomal

Explicar os benefícios do uso de microssomas hepáticos para estudos do metabolismo de drogas?

O fígado é o principal órgão do metabolismo de drogas no corpo. Frações subcelulares como os microsomas hepáticos são modelos in vitro úteis de depuração hepática, pois contêm muitas das enzimas metabolizadoras de fármacos encontradas no fígado. Os microssomas são fáceis de preparar e podem ser armazenados por longos períodos de tempo. Eles são facilmente adaptáveis a telas de alta produtividade que permitem a seleção rápida e barata de um grande número de compostos.

Please provide an overview of Cyprotex’s Microsomal Stability assay.

The microsomes are incubated with the test compound at 37°C in the presence of the co-factor, NADPH, which initiates the reaction. A reação é terminada com a adição de metanol contendo padrão interno. Após a centrifugação, o sobrenadante é analisado no LC-MS/MS. O desaparecimento do composto de teste é monitorado durante um período de tempo de 45 minutos. Um exemplo de um perfil típico de esgotamento é mostrado na Figura 3.

Figura 3
Graph mostra o desaparecimento do composto de teste com o tempo na presença de microsomas hepáticos.

A razão entre a área do pico (área do pico composto/área do pico padrão interno) é traçada em relação ao tempo e o gradiente da linha é determinado.

Como interpreto os dados do ensaio de estabilidade microsomal?

Existem várias formas de utilizar os dados. Em primeiro lugar, os compostos podem ser classificados em termos de seus valores de folga intrínsecos. A menos que o composto seja um pró-fármaco, os compostos muito limpos são geralmente considerados desfavoráveis, pois é provável que sejam rapidamente limpos in vivo, resultando em uma curta duração de ação. As faixas de classificação podem ser usadas para classificar os compostos em baixa, média ou alta depuração. As faixas de classificação CLint para cada espécie da Tabela 1 são calculadas a partir de um rearranjo do modelo bem agitado4 detalhado na equação seguinte, assumindo uma razão de extração (E) de 0,3 e 0,7 para os limites baixo e alto, respectivamente. Esta pode então ser escalada para a folga intrínseca (µL/min/mg de proteína) usando os pesos hepáticos relevantes5 e a concentração de proteína microsomal6, 7 obtida da literatura. Devido à falta de informação na literatura, a concentração de proteína microssomal de macaco e camundongo foi suposta em 50mg de proteína microssomal/g fígado.

CLint =

Where CLH = E x QH

QH = fluxo de sangue hepático (mL/min/kg)5
E = Taxa de extracção
CLH = Limpeza hepática (mL/min/kg)
fu = fracção não ligada no plasma (assumida em 1)

Categoria de desobstrução Desobstrução intrínseca (µL/min/mg de proteína)
Humano Monkey Cão Rato Rato
Baixo < 8.6 < 12,5 < 5,3 < 13,2 < 8,8
Alto > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

Tabela 1: Faixas de classificação tipicamente utilizadas para classificar os compostos em baixa, média ou alta folga.

Segundamente, os dados podem ser utilizados em conjunto com outros parâmetros in vitro para prever a farmacocinética de um composto in vivo utilizando o software de simulação Cloe PK. Em terceiro lugar, as diferenças específicas das espécies no metabolismo de medicamentos podem ser investigadas. Isto pode ser útil na identificação de uma espécie apropriada para o desenvolvimento pré-clínico.

Por que razão eu faria a triagem dos meus compostos no ensaio de estabilidade microscópica em vez do ensaio de estabilidade hepatocitária?

Microssomas são adaptáveis à triagem de alto rendimento e permitem que um grande número de compostos seja triado de forma barata. Nossos clientes tendem a usar este ensaio como uma tela inicial para classificar os compostos de interesse em termos de sua estabilidade metabólica e, em seguida, realizar uma tela secundária em um número menor de compostos selecionados usando hepatócitos.

Que controles são usados no ensaio?

– Dois compostos de controle positivo estão incluídos para cada espécie. Estes compostos são conhecidos por serem metabolizados por microsomas hepáticos.

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Espécie Compostos de controlo
Humano Dextrometorfano
Verapamil
Rato Diazepam
Difenidramina
Mouse Diazepam
Difenidramina
Monkey Quinidina
Verapamil
Dog Dextrometorfano
Verapamil

– Uma incubação de controlo é realizada na ausência de NADPH para revelar qualquer instabilidade química ou nãoDegradação enzimática dependente do NADPH.

– Está incluído um controlo que contém todos os componentes da reacção, com excepção do composto de ensaio. Este controlo identifica qualquer componente potencialmente interferente que possa afectar a análise.

Can I investigar o metabolismo da Fase II nos microssomas do fígado?

O ensaio de estabilidade dos microssomas é usado principalmente para investigar o metabolismo da Fase I usando o NADPH como co-factor enzimático. Contudo, os microssomas do fígado também podem ser utilizados para estudar o metabolismo da Fase II se forem utilizadas as condições de incubação correctas. Recentemente validamos isto utilizando o agente formador de poros alaméticos em conjunto com cofactores apropriados da Fase II, como por exemplo a UDPGA. Isto permite compreender a contribuição que o metabolismo da Fase II tem sobre o metabolismo geral de um composto de teste. Também é possível estudar o metabolismo acoplado das Fases I e II usando todos os co-fatores relevantes na incubação.

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