Microsomale stabiliteitsbepaling

Vragen en antwoorden over microsomale stabiliteit

Leg uit wat de voordelen zijn van het gebruik van levermicrosomen voor onderzoek naar het metabolisme van geneesmiddelen?

De lever is het belangrijkste orgaan voor het metabolisme van geneesmiddelen in het lichaam. Subcellulaire fracties zoals lever microsomen zijn nuttige in vitro modellen van lever klaring omdat ze veel van de drug metaboliserende enzymen gevonden in de lever bevatten. Microsomen zijn gemakkelijk te bereiden en kunnen gedurende lange perioden worden bewaard. Ze zijn gemakkelijk aan te passen aan schermen met hoge doorvoer, waardoor grote aantallen verbindingen snel en goedkoop kunnen worden gescreend.

Geef een overzicht van Cyprotex’s Microsomal Stability assay.

De microsomen worden geïncubeerd met de testverbinding bij 37°C in aanwezigheid van de co-factor, NADPH, die de reactie initieert. De reactie wordt beëindigd door toevoeging van methanol met interne standaard. Na centrifugatie wordt het supernatans geanalyseerd op de LC-MS/MS. Het verdwijnen van de testverbinding wordt gedurende een periode van 45 minuten gevolgd. Een voorbeeld van een typisch depletieprofiel is te zien in figuur 3.

Figuur 3
Grafiek toont de verdwijning van de testverbinding in de loop van de tijd in aanwezigheid van levermicrosomen.

De verhouding ln piekoppervlak (piekoppervlak van de verbinding/intern standaardpiekoppervlak) wordt uitgezet tegen de tijd en de gradiënt van de lijn wordt bepaald.

Hoe interpreteer ik de gegevens van de microsomale stabiliteitsbepaling?

Er zijn verschillende manieren waarop de gegevens kunnen worden gebruikt. Ten eerste kunnen de verbindingen worden gerangschikt op basis van hun intrinsieke klaringswaarden. Tenzij de verbinding een pro-drug is, worden verbindingen met een zeer hoge klaringsgraad over het algemeen als ongunstig beschouwd, omdat zij waarschijnlijk snel in vivo zullen worden geklaard, met een korte werkingsduur als gevolg. Classificatiebanden kunnen worden gebruikt om verbindingen in te delen in lage, gemiddelde of hoge klaring. De CLint-klassificatiebanden voor elke soort in tabel 1 worden berekend met behulp van een herschikking van het goed geroerde model4 dat in de volgende vergelijking wordt beschreven, waarbij wordt uitgegaan van een extractieverhouding (E) van 0,3 en 0,7 voor respectievelijk de lage en hoge grenzen. Dit kan vervolgens worden omgerekend naar intrinsieke klaring (µL/min/mg eiwit) met gebruikmaking van de relevante levergewichten5 en microsomale eiwitconcentratie6, 7 uit de literatuur. Bij gebrek aan literatuurgegevens werd voor de microsomale eiwitconcentratie bij apen en muizen uitgegaan van 50 mg microsomaal eiwit/g lever.

CLint =

Waar CLH = E x QH

QH = leverbloedstroom (mL/min/kg)5
E = extractieverhouding
CLH = leverklaring (mL/min/kg)
fu = fractie ongebonden in plasma (aangenomen op 1)

Klaringscategorie Intrinsieke klaring (µL/min/mg eiwit)
Human Monkey Dog Rat Mouse
Low < 8.6 < 12.5 < 5.3 < 13.2 < 8.8
Hoog > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

Tabel 1: Classificatiebanden die gewoonlijk worden gebruikt om verbindingen in te delen in lage, gemiddelde of hoge klaring.

Ten tweede kunnen de gegevens worden gebruikt in combinatie met andere in vitro parameters om de farmacokinetiek van een verbinding in vivo te voorspellen met behulp van de simulatiesoftware Cloe PK. Ten derde kunnen soortspecifieke verschillen in het metabolisme van geneesmiddelen worden onderzocht. Dit kan nuttig zijn bij het identificeren van een geschikte soort voor preklinische ontwikkeling.

Waarom zou ik mijn verbindingen screenen in de microsomale stabiliteitstest in plaats van de hepatocytenstabiliteitstest?

Microsomen zijn geschikt voor screening met hoge doorvoer en maken het mogelijk grote aantallen verbindingen goedkoop te screenen. Onze klanten gebruiken deze test meestal als een eerste screening om verbindingen van belang te rangschikken in termen van hun metabole stabiliteit, en voeren dan een secundaire screening uit op een kleiner aantal geselecteerde verbindingen met behulp van hepatocyten.

Welke controles worden in de test gebruikt?

– Voor elke soort worden twee positieve controleverbindingen opgenomen. Van deze verbindingen is bekend dat zij door levermicrosomen worden gemetaboliseerd.

Soorten Controleverbindingen
Humane Dextromethorfan
Verapamil
Rat Diazepam
Diphenhydramine
Muis Diazepam
Diphenhydramine
Muis Quinidine
Verapamil
Hond Dextromethorfan
Verapamil

– Er wordt een controle-incubatie uitgevoerd in afwezigheid van NADPH om eventuele chemische instabiliteit of nietNADPH-afhankelijke enzymatische afbraak.

– Er wordt een controle opgenomen die alle reactiecomponenten bevat met uitzondering van de testverbinding. Deze controle identificeert elke potentiële interfererende component die de analyse kan beïnvloeden.

Kan ik fase II-metabolisme in levermicrosomen onderzoeken?

De microsomale stabiliteitstest wordt voornamelijk gebruikt om fase I-metabolisme te onderzoeken met gebruikmaking van NADPH als enzymatische co-factor. Levermicrosomen kunnen echter ook worden gebruikt om het fase II-metabolisme te bestuderen, mits de juiste incubatievoorwaarden worden gebruikt. Wij hebben dit onlangs gevalideerd met gebruikmaking van de porievormende stof alamethicine in combinatie met de juiste fase II-cofactoren, bijvoorbeeld UDPGA. Dit maakt het mogelijk inzicht te krijgen in de bijdrage van het fase II-metabolisme aan het totale metabolisme van een testverbinding. Het is ook mogelijk om gekoppeld fase I- en fase II-metabolisme te bestuderen door alle relevante co-factoren in de incubatie te gebruiken.

Laat een antwoord achter

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.