Mikroszomális stabilitásvizsgálat

Kérdések és válaszok a mikroszomális stabilitásról

Magyarázza el, milyen előnyökkel jár a máj mikroszómák használata a gyógyszeranyagcsere-vizsgálatokban?

A máj a gyógyszeranyagcsere fő szerve a szervezetben. Az olyan szubcelluláris frakciók, mint a máj mikroszómák hasznos in vitro modelljei a máj tisztulásának, mivel számos, a májban található gyógyszer-metabolizáló enzimet tartalmaznak. A mikroszómák könnyen előállíthatók és hosszú ideig tárolhatók. Könnyen adaptálhatók nagy áteresztőképességű szűrésekhez, amelyek lehetővé teszik nagyszámú vegyület gyors és olcsó szűrését.

Kérem, adjon áttekintést a Cyprotex mikroszomális stabilitási vizsgálatáról.

A mikroszómákat 37°C-on inkubálják a vizsgált vegyülettel a kofaktor, a NADPH jelenlétében, amely elindítja a reakciót. A reakciót belső standardot tartalmazó metanol hozzáadásával fejezzük be. A centrifugálást követően a felülúszót LC-MS/MS-en elemezzük. A vizsgált vegyület eltűnését 45 perc alatt követjük nyomon. A 3. ábra egy tipikus kiürülési profilra mutat példát.

3. ábra
A grafikon a tesztvegyület eltűnését mutatja az idő múlásával májmikroszómák jelenlétében.

A ln csúcsterület-arányt (vegyület-csúcsterület/belső standard csúcsterület) az idő függvényében ábrázoljuk, és meghatározzuk az egyenes gradiensét.

Hogyan kell értelmezni a mikroszomális stabilitási vizsgálatból származó adatokat?

Az adatokat többféleképpen lehet felhasználni. Először is, a vegyületek rangsorolhatók az intrinsic clearance értékeik alapján. Hacsak a vegyület nem pro-drog, a nagyon magas tisztulású vegyületek általában kedvezőtlennek tekinthetők, mivel valószínűleg gyorsan tisztulnak in vivo, ami rövid hatástartamot eredményez. Az osztályozási sávok segítségével a vegyületek alacsony, közepes vagy magas clearance-értékekbe sorolhatók. Az 1. táblázatban szereplő egyes fajok CLint besorolási sávjait a következő egyenletben részletezett jól kevert modell4 átrendezéséből számították ki, feltételezve, hogy az alacsony és a magas határértékek esetében az extrakciós arány (E) 0,3, illetve 0,7 legyen. Ez azután az irodalomból származó releváns májtömegek5 és mikroszomális fehérjekoncentrációk6, 7 felhasználásával az intrinsic clearance-re (µL/min/mg fehérje) skálázható. Irodalmi adatok hiányában a majom és egér mikroszomális fehérje koncentrációját 50 mg mikroszomális fehérje/g májnak feltételeztük.

CLint =

Hol CLH = E x QH

QH = máj véráram (ml/perc/kg)5
E = extrakciós hányados
CLH = májklirencia (ml/perc/kg)
fu = a plazmában nem kötött frakció (feltételezve a 1)

Clearance kategória Intrinsic Clearance (µL/min/mg fehérje)
Ember Majom Kutya Patkány Eger
Alacsony < 8.6 < 12.5 < 5.3 < 13.2 < 8.8
High > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

1. táblázat: A vegyületek alacsony, közepes vagy magas clearance-be való besorolásához jellemzően használt osztályozási sávok.

Másrészt az adatok más in vitro paraméterekkel együtt felhasználhatók a vegyület in vivo farmakokinetikájának előrejelzésére a Cloe PK szimulációs szoftver segítségével. Harmadszor, vizsgálhatók a gyógyszer-metabolizmus fajspecifikus különbségei. Ez hasznos lehet a preklinikai fejlesztéshez megfelelő faj azonosításában.

Miért szűrném vegyületeimet a mikroszomális stabilitási teszttel a hepatocita stabilitási teszt helyett?

A mikroszómák alkalmazkodnak a nagy áteresztőképességű szűréshez, és lehetővé teszik nagyszámú vegyület olcsó szűrését. Ügyfeleink általában ezt a vizsgálatot használják kezdeti szűrésként, hogy rangsorolják az anyagcsere-stabilitásuk szempontjából érdekes vegyületeket, majd másodlagos szűrést végeznek a kiválasztott vegyületek kisebb számán hepatociták felhasználásával.

Milyen kontrollokat használnak a vizsgálatban?

– Minden fajhoz két pozitív kontroll vegyületet tartalmaz. Ezekről a vegyületekről ismert, hogy a máj mikroszómák által metabolizálódnak.

.

Species Kontrollvegyületek
Humán Dextrometorfán
Verapamil
Patkány Diazepam
Difenhidramin
Eger Diazepam
Difenhidramin
Majom Kuinidin
Verapamil
Kutya Dextrometorfán
Verapamil

– Kontroll inkubációt végzünk NADPH hiányában, hogy felfedezzük az esetleges kémiai instabilitást vagy nem-NADPH-függő enzimatikus lebomlást.

– Egy kontrollt is tartalmaz, amely a vizsgált vegyület kivételével minden reakciókomponenst tartalmaz. Ez a kontroll azonosít minden olyan potenciális zavaró komponenst, amely befolyásolhatja az elemzést.

Vizsgálhatom a II. fázisú metabolizmust májmikroszómákban?

A mikroszomális stabilitásvizsgálatot elsősorban az I. fázisú metabolizmus vizsgálatára használják, NADPH-t használva enzimkofaktorként. A máj mikroszómák azonban a II. fázisú anyagcsere vizsgálatára is felhasználhatók, ha megfelelő inkubációs körülményeket alkalmazunk. Ezt nemrégiben validáltuk a pórusképző anyag, az alamethicin felhasználásával, megfelelő II. fázis kofaktorokkal, például UDPGA-val együtt. Ez lehetővé teszi annak megértését, hogy a Fázis II metabolizmus milyen mértékben járul hozzá a vizsgált vegyület teljes metabolizmusához. Lehetőség van az I. és II. fázisú metabolizmus összekapcsolásának vizsgálatára is, ha az inkubációban az összes releváns kofaktort használjuk.

Leave a Reply

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.