Essai de stabilité microsomale

Questions et réponses sur la stabilité microsomale

Expliquez les avantages de l’utilisation de microsomes hépatiques pour les études sur le métabolisme des médicaments ?

Le foie est le principal organe du métabolisme des médicaments dans le corps. Les fractions subcellulaires telles que les microsomes hépatiques sont des modèles in vitro utiles de la clairance hépatique car elles contiennent de nombreuses enzymes de métabolisation des médicaments présentes dans le foie. Les microsomes sont faciles à préparer et peuvent être conservés pendant de longues périodes. Ils sont facilement adaptables aux cribles à haut débit qui permettent de cribler un grand nombre de composés rapidement et à moindre coût.

Veuillez fournir un aperçu du test de stabilité microsomale de Cyprotex.

Les microsomes sont incubés avec le composé à tester à 37°C en présence du cofacteur, le NADPH, qui initie la réaction. La réaction est terminée par l’ajout de méthanol contenant un standard interne. Après centrifugation, le surnageant est analysé sur le LC-MS/MS. La disparition du composé testé est suivie sur une période de 45 minutes. Un exemple de profil de disparition typique est présenté dans la figure 3.

Figure 3
Graphique montre la disparition du composé à tester avec le temps en présence de microsomes hépatiques.

Le rapport ln de l’aire du pic (aire du pic du composé/aire du pic de la norme interne) est tracé en fonction du temps et le gradient de la ligne est déterminé.

Comment interpréter les données de l’essai de stabilité microsomale ?

Il existe plusieurs façons d’utiliser les données. Tout d’abord, les composés peuvent être classés en fonction de leurs valeurs de clairance intrinsèque. À moins que le composé ne soit une pro-drogue, les composés à très forte clairance sont généralement considérés comme défavorables car ils sont susceptibles d’être rapidement éliminés in vivo, ce qui entraîne une courte durée d’action. Les bandes de classification peuvent être utilisées pour classer les composés dans les catégories de clairance faible, moyenne ou élevée. Les bandes de classification CLint pour chaque espèce dans le tableau 1 sont calculées à partir d’un réarrangement du modèle bien agité4 détaillé dans l’équation suivante en supposant un rapport d’extraction (E) de 0,3 et 0,7 pour les limites basse et haute, respectivement. Cette valeur peut ensuite être mise à l’échelle de la clairance intrinsèque (µL/min/mg de protéine) en utilisant les poids pertinents du foie5 et la concentration de protéines microsomales6, 7 obtenus dans la littérature. En raison du manque d’informations dans la littérature, la concentration de protéines microsomales de singe et de souris a été supposée à 50mg de protéines microsomales/g de foie.

CLint =

Où CLH = E x QH

QH = débit sanguin hépatique (mL/min/kg)5
E = rapport d’extraction
CLH = clairance hépatique (mL/min/kg)
fu = fraction non liée dans le plasma (supposée à 1)

.

Catégorie de clairance C clairance intrinsèque (µL/min/mg de protéines)
Homme Singe Chien Rat Souris
faible < 8.6 < 12,5 < 5,3 < 13,2 < 8,8
High > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

Tableau 1 : bandes de classification généralement utilisées pour classer les composés en clairance faible, moyenne ou élevée.

Deuxièmement, les données peuvent être utilisées conjointement avec d’autres paramètres in vitro pour prédire la pharmacocinétique d’un composé in vivo en utilisant le logiciel de simulation Cloe PK. Troisièmement, les différences spécifiques aux espèces dans le métabolisme des médicaments peuvent être étudiées. Cela peut être utile pour identifier une espèce appropriée pour le développement préclinique.

Pourquoi voudrais-je cribler mes composés dans l’essai de stabilité microsomale plutôt que dans l’essai de stabilité hépatocytaire ?

Les microsomes sont adaptables au criblage à haut débit et permettent de cribler un grand nombre de composés à moindre coût. Nos clients ont tendance à utiliser ce test comme un écran initial pour classer les composés d’intérêt en termes de stabilité métabolique, puis à effectuer un écran secondaire sur un plus petit nombre de composés sélectionnés en utilisant des hépatocytes.

Quels contrôles sont utilisés dans le test ?

– Deux composés témoins positifs sont inclus pour chaque espèce. Ces composés sont connus pour être métabolisés par les microsomes hépatiques.

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.

Espèces Composés témoins
Humain Dextrométhorphane
Vérapamil
Rat Diazépam
Diphénhydramine
Souris Diazépam
Diphénhydramine
Monkey Quinidine
Vérapamil
Chien Dextrométhorphane
Vérapamil

– Une incubation témoin est réalisée en l’absence de NADPH afin de révéler toute instabilité chimique ou enzymatique non.dégradation enzymatique non dépendante du NADPH.

– On inclut un contrôle qui contient tous les composants de la réaction à l’exception du composé à tester. Ce contrôle identifie tout composant interférant potentiel qui pourrait affecter l’analyse.

Puis-je étudier le métabolisme de phase II dans les microsomes hépatiques ?

Le test de stabilité microsomale est principalement utilisé pour étudier le métabolisme de phase I en utilisant le NADPH comme cofacteur enzymatique. Cependant, les microsomes hépatiques peuvent également être utilisés pour étudier le métabolisme de phase II si les conditions d’incubation correctes sont utilisées. Nous avons récemment validé cette méthode en utilisant l’agent porogène alaméthicine en conjonction avec des cofacteurs de phase II appropriés, par exemple UDPGA. Cela vous permet de comprendre la contribution du métabolisme de phase II sur le métabolisme global d’un composé à tester. Il est également possible d’étudier le métabolisme couplé de la phase I et de la phase II en utilisant tous les cofacteurs pertinents dans l’incubation.

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