Mikrosomaalisen stabiilisuuden määritys

Kysymyksiä ja vastauksia mikrosomaalisesta stabiilisuudesta

Kerro, mitä hyötyä on käyttää maksan mikrosomeja lääkeaineiden aineenvaihduntatutkimuksissa?

Maksa on lääkeaineiden metabolian pääelin elimistössä. Subcellulaariset fraktiot, kuten maksan mikrosomit, ovat käyttökelpoisia in vitro -malleja maksan puhdistumalle, koska ne sisältävät monia maksassa esiintyviä lääkeaineita metaboloivia entsyymejä. Mikrosomeja on helppo valmistaa, ja niitä voidaan säilyttää pitkiä aikoja. Ne ovat helposti mukautettavissa korkean läpimenon seulontoihin, joiden avulla voidaan seuloa suuria määriä yhdisteitä nopeasti ja edullisesti.

Kertokaa yleiskatsaus Cyprotexin mikrosomaaliseen stabiilisuusmääritykseen.

Mikrosomeja inkuboidaan testattavan yhdisteen kanssa 37 °C:n lämpötilassa reaktion käynnistävän kofaktorin, NADPH:n, läsnä ollessa. Reaktio lopetetaan lisäämällä metanolia sisältävää sisäistä standardia. Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti analysoidaan LC-MS/MS:llä. Testattavan yhdisteen häviämistä seurataan 45 minuutin ajan. Esimerkki tyypillisestä häviämisprofiilista on esitetty kuvassa 3.

Kuva 3
Kuvassa näytetään testiyhdisteen häviäminen ajan myötä maksan mikrosomien läsnä ollessa.

Piikin pinta-alan ln-suhde (yhdisteen piikin pinta-ala/sisäisen standardin piikin pinta-ala) on piirretty ajan suhteen ja määritetty viivan gradientti.

Miten tulkitsen mikrosomaalisen stabiilisuusmäärityksen tietoja?

Tietoja voidaan käyttää usealla tavalla. Ensinnäkin yhdisteet voidaan asettaa paremmuusjärjestykseen niiden sisäisten puhdistuma-arvojen perusteella. Ellei yhdiste ole pro-lääke, hyvin korkeasti puhdistuvia yhdisteitä pidetään yleensä epäedullisina, koska ne todennäköisesti puhdistuvat nopeasti in vivo, mikä johtaa lyhyeen vaikutusaikaan. Luokituskaistoja voidaan käyttää yhdisteiden luokitteluun matalaan, keskinkertaiseen tai korkeaan puhdistumaan. Taulukossa 1 esitetyt CLint-luokituskaistat kullekin lajille on laskettu seuraavassa yhtälössä esitetyn hyvin sekoitetun mallin4 uudelleenjärjestelyllä olettaen, että uuttumissuhde (E) on 0,3 ja 0,7 matalan ja korkean rajan osalta. Tämä voidaan sitten skaalata sisäiseen puhdistumaan (µL/min/mg proteiinia) käyttäen kirjallisuudesta saatuja maksan painoja5 ja mikrosomaalisten proteiinien pitoisuuksia6,7 . Kirjallisuustietojen puuttuessa apinan ja hiiren mikrosomaalisen proteiinin pitoisuudeksi oletettiin 50 mg mikrosomaalista proteiinia/g maksa.

CLint =

Jossa CLH = E x QH

QH = maksan verenkierto (ml/min/kg)5
E = uuttosuhde
CLH = maksan sisäinen puhdistuma (ml/min/kg)5
fu = plasman sitomaton osuus (oletettu klo 1)

Clearance Category Intrinsic Clearance (µL/min/mg proteiinia)
ihminen apina koira rotta hiiri
alhainen < 8.6 < 12.5 < 5.3 < 13.2 < 8.8
High > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

Taulukko 1: Luokituskaistat, joita käytetään tyypillisesti yhdisteiden luokittelussa matalaan, keskinkertaiseen tai korkeaan puhdistumaan.

Toiseksi tietoja voidaan käyttää yhdessä muiden in vitro -parametrien kanssa ennustamaan yhdisteen farmakokinetiikkaa in vivo simulointiohjelmiston Cloe PK avulla. Kolmanneksi voidaan tutkia lääkeaineen metabolian lajikohtaisia eroja. Tämä voi olla hyödyllistä sopivan lajin määrittämisessä prekliinistä kehitystä varten.

Miksi seulon yhdisteeni mikrosomaalisessa stabiilisuusmäärityksessä hepatosyyttien stabiilisuusmäärityksen sijaan?

Mikrosomit soveltuvat korkean läpimenotehon seulontaan, ja niiden avulla voidaan seuloa suuria määriä yhdisteitä edullisesti. Asiakkaillamme on tapana käyttää tätä määritystä alustavana seulontana kiinnostavien yhdisteiden asettamiseksi paremmuusjärjestykseen niiden metabolisen stabiilisuuden kannalta ja suorittaa sitten toissijainen seulonta pienemmälle määrälle valittuja yhdisteitä hepatosyyttien avulla.

Mitä kontrolleja määrityksessä käytetään?

– Kullekin lajille on mukana kaksi positiivista kontrollia. Näiden yhdisteiden tiedetään metaboloituvan maksan mikrosomeissa.

Laji Kontrolliyhdisteet
ihminen Deksstrometorfaani
Verapamiili
Kissa Diatsepaami
Difenhydramiini
Hiiri Diatsepaami
Difenhydramiini
Apina Kuinidiini
Verapamiili
Koira Deksstrometorfaani
Verapamiili

– Kontrolli-inkubaatio suoritetaan ilman NADPH:ta mahdollisten kemiallisten epävakkuuksien tai ei-.NADPH:sta riippuvaista entsymaattista hajoamista.

– Mukana on kontrolli, joka sisältää kaikki reaktiokomponentit testiyhdistettä lukuun ottamatta. Tämä kontrolli tunnistaa kaikki mahdolliset häiritsevät komponentit, jotka voivat vaikuttaa analyysiin.

Voinko tutkia vaiheen II metaboliaa maksan mikrosomeissa?

Mikrosomaalista stabiilisuusmääritystä käytetään ensisijaisesti vaiheen I metabolian tutkimiseen käyttäen NADPH:ta entsyymin kofaktorina. Maksan mikrosomeja voidaan kuitenkin käyttää myös vaiheen II metabolian tutkimiseen, jos käytetään oikeita inkubaatio-olosuhteita. Olemme hiljattain validoineet tämän käyttämällä huokosten muodostavaa ainetta alametisiiniä yhdessä sopivien vaiheen II kofaktorien, esimerkiksi UDPGA:n, kanssa. Näin voidaan saada käsitys siitä, mikä on vaiheen II metabolian vaikutus testattavan yhdisteen kokonaismetaboliaan. On myös mahdollista tutkia yhdistettyä vaiheen I ja vaiheen II metaboliaa käyttämällä inkubaatiossa kaikkia asiaankuuluvia kofaktoreita.

Jätä vastaus

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.