Ensayo de estabilidad microsómica

Preguntas y respuestas sobre la estabilidad microsómica

¿Explique las ventajas de utilizar microsomas hepáticos para estudios de metabolismo de fármacos?

El hígado es el principal órgano de metabolismo de fármacos en el cuerpo. Las fracciones subcelulares, como los microsomas hepáticos, son modelos útiles in vitro del aclaramiento hepático, ya que contienen muchas de las enzimas metabolizadoras de fármacos que se encuentran en el hígado. Los microsomas son fáciles de preparar y pueden almacenarse durante largos periodos de tiempo. Se adaptan fácilmente a las pruebas de alto rendimiento que permiten analizar un gran número de compuestos de forma rápida y económica.

Por favor, proporcione una descripción general del ensayo de estabilidad microsomal de Cyprotex.

Los microsomas se incuban con el compuesto de prueba a 37°C en presencia del cofactor, NADPH, que inicia la reacción. La reacción se termina con la adición de metanol que contiene un estándar interno. Tras la centrifugación, el sobrenadante se analiza en el LC-MS/MS. La desaparición del compuesto de prueba se monitoriza durante un periodo de tiempo de 45 minutos. En la Figura 3 se muestra un ejemplo de un perfil de desaparición típico.

Figura 3
El gráfico muestra la desaparición del compuesto de ensayo con el tiempo en presencia de microsomas hepáticos.

La relación del área del pico ln (área del pico del compuesto/área del pico del estándar interno) se traza frente al tiempo y se determina el gradiente de la línea.

¿Cómo se interpretan los datos del ensayo de estabilidad microsomal?

Hay varias maneras de utilizar los datos. En primer lugar, los compuestos pueden clasificarse en función de sus valores de aclaramiento intrínseco. A menos que el compuesto sea un profármaco, los compuestos con un aclaramiento muy elevado se consideran generalmente desfavorables, ya que es probable que se eliminen rápidamente in vivo, lo que da lugar a una corta duración de la acción. Las bandas de clasificación pueden utilizarse para clasificar los compuestos en aclaramiento bajo, medio o alto. Las bandas de clasificación CLint para cada especie en la Tabla 1 se calculan a partir de un reordenamiento del modelo bien agitado4 detallado en la siguiente ecuación, asumiendo una relación de extracción (E) de 0,3 y 0,7 para los límites bajo y alto, respectivamente. Esto puede ser escalado al aclaramiento intrínseco (µL/min/mg de proteína) usando los pesos hepáticos relevantes5 y la concentración de proteína microsomal6, 7 obtenida de la literatura. Debido a la falta de información en la literatura, la concentración de proteína microsomal de mono y ratón se asumió en 50 mg de proteína microsomal/g de hígado.

CLint =

Donde CLH = E x QH

QH = flujo sanguíneo hepático (mL/min/kg)5
E = Ratio de extracción
CLH = aclaramiento hepático (mL/min/kg)
fu = fracción no ligada en plasma (asumida en 1)

Categoría de aclaramiento Aclaramiento intrínseco (µL/min/mg de proteína)
Humano Mono Perro Rata Ratón
Bajo < 8.6 < 12,5 < 5,3 < 13,2 < 8,8
Alto > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

Tabla 1: Bandas de clasificación utilizadas habitualmente para clasificar los compuestos en aclaramiento bajo, medio o alto.

En segundo lugar, los datos pueden utilizarse junto con otros parámetros in vitro para predecir la farmacocinética de un compuesto in vivo utilizando el software de simulación Cloe PK. En tercer lugar, se pueden investigar las diferencias específicas de cada especie en el metabolismo del fármaco. Esto puede ser útil para identificar una especie apropiada para el desarrollo preclínico.

¿Por qué debería examinar mis compuestos en el ensayo de estabilidad microsomal en lugar del ensayo de estabilidad de hepatocitos?

Los microsomas se adaptan al cribado de alto rendimiento y permiten examinar un gran número de compuestos de forma económica. Nuestros clientes tienden a utilizar este ensayo como pantalla inicial para clasificar los compuestos de interés en términos de su estabilidad metabólica, y luego realizar una pantalla secundaria en un número más pequeño de compuestos seleccionados utilizando hepatocitos.

¿Qué controles se utilizan en el ensayo?

– Se incluyen dos compuestos de control positivo para cada especie. Se sabe que estos compuestos son metabolizados por los microsomas hepáticos.

Especie Compuestos de control
Humano Dextrometorfano
Verapamil
Rata Diazepam
Difenhidramina
Ratón Diazepam
Difenhidramina
Mono Quinidina
Verapamil
Perro Dextrometorfano
Verapamil

– Se realiza una incubación de control en ausencia de NADPH para revelar cualquier inestabilidad química o la nodegradación enzimática no dependiente del NADPH.

– Se incluye un control que contiene todos los componentes de la reacción a excepción del compuesto de ensayo. Este control identifica cualquier componente potencialmente interferente que pueda afectar al análisis.

¿Puedo investigar el metabolismo de fase II en microsomas de hígado?

El ensayo de estabilidad microsomal se utiliza principalmente para investigar el metabolismo de fase I utilizando NADPH como cofactor enzimático. Sin embargo, los microsomas hepáticos también pueden utilizarse para estudiar el metabolismo de fase II si se utilizan las condiciones de incubación correctas. Recientemente hemos validado esto utilizando el agente formador de poros alamethicin junto con los cofactores apropiados de la Fase II, por ejemplo UDPGA. Esto permite comprender la contribución del metabolismo de fase II en el metabolismo general de un compuesto de prueba. También es posible estudiar el metabolismo acoplado de fase I y fase II utilizando todos los cofactores pertinentes en la incubación.

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