Microsomal stability assay

Spørgsmål og svar om mikrosomal stabilitet

Forklar fordelene ved at bruge levermikrosomer til undersøgelser af lægemiddelmetabolisme?

Leveren er det vigtigste organ for lægemiddelmetabolisme i kroppen. Subcellulære fraktioner såsom levermikrosomer er nyttige in vitro-modeller for hepatisk clearance, da de indeholder mange af de lægemiddelmetaboliserende enzymer, der findes i leveren. Mikrosomer er lette at fremstille og kan opbevares i lang tid. De kan let tilpasses til high throughput screeninger, som gør det muligt at screene et stort antal forbindelser hurtigt og billigt.

Giv venligst en oversigt over Cyprotex’ Microsomal Stability assay.

Mikrosomerne inkuberes med testforbindelsen ved 37°C i nærvær af co-faktoren NADPH, som initierer reaktionen. Reaktionen afsluttes ved tilsætning af methanol indeholdende intern standard. Efter centrifugering analyseres supernatanten på LC-MS/MS. Testforbindelsens forsvinden overvåges over en periode på 45 minutter. Et eksempel på en typisk udtømningsprofil er vist i figur 3.

Figur 3
Grafen viser testforbindelsens forsvinden med tiden i tilstedeværelse af levermikrosomer.

Det ln-toparealforhold (forbindelsestopareal/intern standardtopareal) er plottet mod tiden, og gradienten af linjen er bestemt.

Hvordan fortolker jeg dataene fra det mikrosomale stabilitetsassay?

Der er flere måder, hvorpå dataene kan anvendes. For det første kan stofferne rangordnes i forhold til deres intrinsiske clearance-værdier. Medmindre stoffet er et pro-drug, anses meget stærkt clearede stoffer generelt for at være ugunstige, da de sandsynligvis hurtigt cleares in vivo, hvilket resulterer i en kort virkningsvarighed. Klassifikationsbånd kan anvendes til at kategorisere stoffer i lav, medium eller høj clearance. CLint-klassifikationsbåndene for hver art i tabel 1 er beregnet ud fra en omlægning af den velomrørte model4 , der er beskrevet i følgende ligning, idet der antages et ekstraktionsforhold (E) på 0,3 og 0,7 for henholdsvis den lave og den høje grænse. Dette kan derefter skaleres til intrinsisk clearance (µL/min/mg protein) ved hjælp af de relevante levervægte5 og den mikrosomale proteinkoncentration6, 7 , der er hentet fra litteraturen. På grund af manglende litteraturoplysninger blev mikrosomalproteinkoncentrationen for abe og mus antaget til 50 mg mikrosomalprotein/g lever.

CLint =

Hvor CLH = E x QH

QH = leverblodgennemstrømning (mL/min/kg)5
E = Ekstraktionsforhold
CLH = hepatisk clearance (mL/min/kg)
fu = fraktion ubundet i plasma (antaget til 1)

Clearancekategori Intrinsisk clearance (µL/min/mg protein)
Menneske Affe Hund Rat Mus
Lavt < 8.6 < 12.5 < 5.3 < 13.2 < 8.8
Høj > 47.0 > 67.8 > 28.9 > 71.9 > 48.0

Tabel 1: Klassifikationsbånd, der typisk anvendes til at kategorisere forbindelser i lav, middel eller høj clearance.

For det andet kan dataene anvendes sammen med andre in vitro-parametre til at forudsige farmakokinetikken for et stof in vivo ved hjælp af simuleringsprogrammet Cloe PK. For det tredje kan artsspecifikke forskelle i lægemiddelmetabolismen undersøges. Dette kan være nyttigt til at identificere en passende art til præklinisk udvikling.

Hvorfor vil jeg screene mine forbindelser i det mikrosomale stabilitetsassay frem for hepatocytstabilitetsassayet?

Mikrosomer kan tilpasses til high throughput screening og gør det muligt at screene et stort antal forbindelser til en billig pris. Vores kunder har tendens til at bruge dette assay som en indledende screening for at rangordne forbindelser af interesse med hensyn til deres metaboliske stabilitet og derefter udføre en sekundær screening på et mindre antal udvalgte forbindelser ved hjælp af hepatocytter.

Hvilke kontroller anvendes i assayet?

– Der medfølger to positive kontrolforbindelser for hver art. Disse forbindelser er kendt for at blive metaboliseret af levermikrosomer.

Species Kontrolforbindelser
Human Dextromethorphan
Verapamil
Rat Diazepam
Diphenhydramin
Mus Diazepam
Diphenhydramin
Affe Quinidin
Verapamil
Hund Dextromethorphan
Verapamil

– Der udføres en kontrolinkubation i fravær af NADPH for at afsløre eventuel kemisk ustabilitet eller ikkeNADPH-afhængig enzymatisk nedbrydning.

– Der medtages en kontrol, som indeholder alle reaktionskomponenter med undtagelse af teststoffet. Denne kontrol identificerer enhver potentiel interfererende komponent, som kan påvirke analysen.

Kan jeg undersøge fase II-metabolisme i levermikrosomer?

Det mikrosomale stabilitetsassay anvendes primært til at undersøge fase I-metabolisme ved hjælp af NADPH som enzymkofaktor. Levermikrosomer kan dog også anvendes til at undersøge fase II-metabolisme, hvis de korrekte inkubationsbetingelser anvendes. Vi har for nylig valideret dette ved hjælp af det poredannende middel alamethicin sammen med passende fase II-kofaktorer, f.eks. UDPGA. Dette giver mulighed for at få en forståelse af, hvilket bidrag fase II-metabolismen har til den samlede metabolisme af en testforbindelse. Det er også muligt at undersøge koblet fase I- og fase II-metabolisme ved at anvende alle de relevante co-faktorer i inkubationen.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.